PENGECATAN DAN MORFOLOGI MIKROORGANISME

I.     PENDAHULUAN

A.     Latar Belakang

Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, ini akan mempersulit untuk dilihat atau diteliti sekalipun dibawah mikroskop. Hal tersebut disebabkan karena banyak mikroba yang tidak mempunyai zat warna, seperti pada umumnya yang didapatkan pada bakteri. Berbeda dengan mikroalga yang  jelas mempunyai butir-butir atau serat warna dalam selnya. Bakteri yang masih hidup tidak nampak jelas bentuk maupun sifat-sifat morfologi lainnya. Bakteri tunggal, yaitu yang berupa satu sel saja hanya kelihatan bening saja, walaupun bakteri itu diamblkan dari suatu koloni tertentu. Oleh karena itu, untuk memperlihatkan bagian-bagian sel diperlukan pewarnaan.

Banyak senyawa organik berwarna (zat pewarna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis. Telah dikembangkan prosedur-prosedur pewarnaan untuk mengamati dengan lebih baik tampang morfologi mikroorganisme secara kasar, mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme, dan membantu mengidentifikasi juga membedakan organisme yang serupa. Sedangkan langkah-langkah utama dalam mempersiapkan spesimen mikroba yang diwarnai untuk pemeriksaan mikroskopik antara lain, penempatan olesan atau lapisan tipis spesimen pada kaca objek, fiksasi olesan itu pada kaca objek, serta aplikasi tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial).

Pewarnaan gram ditemukan pada tahun 1884 oleh Cristian Gram, seorang ahli bakteriologi Denmark. Mula-mula sel-sel diwarnai dengan pewarna ungu yang disebut violet kristal. Kemudian preparat itu diberi alkohol atau aseton, yang mencuci violet kristal tadi sel-sel gram negatif. Untuk dapat melihatnya perlu menggunakan warna tandingan dan warna lain (misalnya merah jambu safranin) bakteri yang tidak luntur warnanya oleh alkohol atau aseton itu disebut gram positif.

B.       Rumusan Masalah

1.     Bagaimana cara mempelajari dasar kimiawi dan teoritis pewarnaan   bakteri ?

2.     Bagaimana cara mempelajari teknik pembuatan apusan dalam pewarnaan bakteri ?

3.     Bagaimana cara mempelajari tata cara pewarnaan sederhana, pewarnaan negatif dan pewarnaan gram ?

C.     Tujuan

      Adapun tujuan dari praktikum kali ini yaitu sebagai berikut:

1.     Mempelajari dasar kimiawi dan teoritis pewarnaan bakteri.

2.     Mempelajari teknik pembuatan apusan dalam pewarnaan bakteri.

3.     mempelajari tata cara pewarnaan sederhana, pewarnaan negatif dan    pewarnaan gram.

                                              II.  TINJAUAN PUSTAKA

Banyak senyawa organik berwarna (zat pewarna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis. Telah dikembangkan prosedur-prosedur pewarnaan untuk mengamati dengan lebih baik tampang morfologi mikroorganisme secara kasar, mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme, dan membantu mengidentifikasi juga membedakan organisme yang serupa. Sedangkan langkah-langkah utama dalam mempersiapkan spesimen mikroba yang diwarnai untuk pemeriksaan mikroskopik antara lain, penempatan olesan atau lapisan tipis spesimen pada kaca objek, fiksasi olesan itu pada kaca objek, serta aplikasi tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial) (Pelczar, 1986).

Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, ini akan mempersulit untuk dilihat atau diteliti sekalipun dibawah mikroskop. Hal tersebut disebabkan karena banyak mikrobe yang tidak mempunyai zat warna, seperti pada umumnya yang didapatkan pada bakteri. Berbeda dengan mikroalga yang jelas mempunyai butir-butir atau serat warna dalam selnya. Bakteri yang masih hidup tidak nampak jelas bentuk maupun sifat-sifat morfologi lainnya. Bakteri tunggal, yaitu yang berupa satu sel saja hanya kelihatan bening saja, walaupun bakteri itu diamblkan dari suatu koloni tertentu. Oleh karena itu, untuk memperlihatkan bagian-bagian sel diperlukan pewarnaan (Lud, 2004).

Pewarnaan gram ditemukan bertahun-tahun yang lalu (1884) oleh Cristian Gram, seorang ahli bakteriologi Denmark. Mula-mula sel-sel diwarnai dengan pewarna ungu yang disebut violet kristal. Kemudian preparat itu diberi alkohol atau aseton, yang mencuci violet kristal tadi sel-sel gram negatif. Untuk dapat melihatnya perlu menggunakan warna tandingan dan warna lain (misalnya merah jambu safranin) bakteri yang tidak luntur warnanya oleh alkohol/aseton itu disebut gram positif (Kimball, 1994).

Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa sehingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel tersebut dengan zat-zat warna. Pemeriksaan morfologi penting untuk mengenal bakteri. Disamping itu, diperlukan juga pengenalan sifat-sifat fisiologisnya, bahkan sifat-sifat fisiologisnya kebanyakan merupakan faktor penentu dalam mengenal nama spesies suatu bakteri. Namun beberapa bakteri yang ditemukan memiliki spesies yang sama. Oleh karena itu banyak bakteri yang memiliki nama bakteri yang sama (Adam, 1992).

Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (kokus, basilus, vibrio, spirilium dan sebagainya) dan baha-bahan lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai. Disamping itu dapat pula diamati struktur-struktur tertentu seperti endospora. Berbeda dengan spesimen hidup, sel-sel yang diwarnai terfikasi pada kaca objek sehingga dapat disimpan sebagai dokumentasi untuk jangka waktu lama (Hadioetomo, 1993).

Ada kalanya, setelah suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer, maka semua zat warna terhapus. Ditinjau dari tujuan pewarnaan sudah barang tentu pewarnaan tersebut merupakan kegagalan. Akan tetapi ada juga preparat yang tahan asam encer, misalnya basil-basil TBC dan basil-basil yang berspora. Maka kita katakan, bahwa bateri tersebut adalah bakteri tahan asam; ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesias (Dwidjoseputro, 2005).

Dengan pewarnaan yang baik kita dapat membedakan dengan jelas Basil Tahan Asam (BTA) dari kuman lain, karena BTA terwarnai lebih kuat dari kuman lain. Proses pewarnaan sangat dipengaruhi oleh suhu, kelembaban udara dan zat warna yang dipakai. Zat warna yang tersimpan terlalu lama dapat mempengaruhi hasil pewarnaan. Disamping itu jenis zat warna yang dipakai dan sinar matahari sangat berpengaruh pada penyimpanan sediaan yang telah diwarnai. Sinar matahari akan mempercepat lunturnya warna kuman (Sandjaja, 1992).

III. METODE PRAKTIKUM                                     

A.     Waktu dan Tempat

Pada praktikum kali ini yang berjudul ”Pengecatan dan Morfologi Mikroorganisme” dilaksanakan pada hari Sabtu, tanggal 19 April 2014, pada pukul 13.00-17.00 WITA. Bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas MIPA Unhalu Kendari.

B.     Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan pada praktikum kali ini yaitu dapat dilihat pada  tabel 1.

Tabel 1. Alat-alat yang digunakan dan fungsinya

No	Nama Alat	Fungsi
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.	Kaca objek dan kaca penutup Jarum ose Mikroskop Lampu spirtus/bunsen Pipet tetes Kamera Alat tulis Tissu	Untuk meletakan dan menutup sampel pengamatan. Untuk mengambil atau menggores medium biakan. Untuk mengamati bakteri. Untuk sterilisasi secara fisik dan untuk memijarkan ose. untuk megambil larutan. Untuk mengambil gambar. Untuk menulis hasil pengamatan. Untuk mengeringkan alat-alat yang digunakan.

Sedangkan bahan-bahan yang digunakan pada praktikum ini yaitu dapat dilihat pada tabel 2.

Tabel 2. Bahan-bahan yang digunakan dan fungsinya

No	Nama Bahan	Fungsi
1 2 3 4 5 6	Aquades steril Alkohol Kristal violet dan safranin Iodine/lugol Kultur (biakan) murni bakteri	Sebagai zat pelarut/larutan pemucat. Untuk membersihkan kaca objek sebelum pewarnaan. Sebagai zat pewarna. Sebagai zat pewarna. Sebagai sampel pengamatan. Sebagai obyek pengamatan.

C.     Prosedur Kerja

1.      Pengecatan Negatif (Asam)

Ø  Mengambil 2 kaca objek, memberi 1 tetes nigrosin pada bagian ujung kanan salah satu kaca objek

Ø  Mengambil sedikit biakan bakteri dengan ose secara aseptik, mencampur dengan tinta cina diatas kaca onjek

Ø  Tempat salah satu sisi kaca objek yang ada pada campuran ini kemudian gesekkan tinta cina dan biakan bakteri tersebar merata membentuk apusan tipis dipermukaan kaca objek pertama

Ø  Membiarkan preparat mengering di udara, jangan dipanaskan atau disentuhkan kertas saring

Ø  Mengamati apusan dengan menggunakan minyak imersi dibawah mikroskop

Ø  Menggambar dan memberi keterangan mengenai apa yang tampak dibawah mikroskop.

2.      Pengecatan Langsung (Basa/Positif)

Ø  Membuat apusan dari masing-masing biakan bakteri

Ø  Meneteskan larutan zat warna biru metilen atau karbol fuksin dan membiarkannya selama 30 detik

Ø  Mencuci dan mengeringkan  dengan hati-hati dengan kertas saring

Ø  Menetesi apusan yang telah diwarnai dengan minyak emersi lalu amati dengan mikroskop pada pembesaran 100X

Ø  Menggambar bentuk sel dari masing-masing biakan berikut warnanya

3.      Pewarnaan Gram

Ø  Membuat apusan dari tiap biakan bakteri lalu Meneteskan pewarnaan dasar larutan kristal violet dan membiarkannya selama 1-2 menit

Ø  Mencuci kelebihan zat pewarna dengan air mengalir

Ø  Menetesi apusan yang telah dicuci dengan iodin atau lugol dan biarkan 1-2 menit dan Memberi larutan pemucat selama 10-20 detik

Ø  Mencuci apusan dengan air mengalir dan mengeringkannya dengan kertas saring

Ø  Mengamati apusan dibawah mikroskop, menggambar dan memberi keterangan.

B.  Pembahasan

Bakteri merupakan organisme yang sangat kecil (berukuran mikroskopis). Bakteri rata-rata berukuran lebar 0,5 – 1 mikron dan panjang hingga 10 mikron. Ini berarti jasad renik ini sangat tipis hingga bisa menembus cahaya. Akibatnya pada mikroskop tidak tampak jelas dan sukar untuk melihat bagian-bagiannya. Untuk melihat bakteri dengan jelas, tubuhnya perlu diisi dengan zat warna, pewarnaan ini disebut pengecatan bakteri.

Pengecatan gram meliputi 4 tingkatan yaitu: pemberian cat utama, pengintensifan cat utama, pencucian (deklorisasi), dan pemberian cat penutup. Pengecatan gram termasuk pengecatan diferensial karena dapat membedakan bakteri-bakteri yang bersifat gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif yaitu bakteri yang mengikat cat utama dengan kuat, sehingga tidak dapat dilunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh cat lawan. Sedangkan bakteri gram negatif yaitu bakteri yang dayanya mengikat cat utama tidak kuat, sehingga dapat diliunturkan oleh cat lawan. Selain dari kedua jenis bakteri tersebut, terdapat pula bakteri yang bersifat gram variabel. Bakteri-bakteri ini mempunyai sifat intermedier antara gram positif dan negatif, yaitu  kadang bersifat gram positif dan kadang pula bersifat gram negatif.

Perbedaan bakteri gram positif dan negatif dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu : pertama, perubahan keasaman dimana jika pH dari bakteri tersebut turun, maka kemungkinan bersifat  bakteri yang bersifat gram positif berubah menjadi negatif dan sebaliknya jika pH naik gram negatif menjadi gram positif. Kedua, penyimpangan cara pengecatan misalnya pencucian yang terlalu lama menyebabkan bakteri gram positif menjadi negatif. Ketiga, faktor medium dimana jika bakteri gram positif yang lemah terlalu lama ditumbuhkan dalam medium yang mengandung bahan yang mudah difermentasi dapat berubah menjadi gram negatif. Keempat, umur bakteri dimana bakteri-bakteri gram positif yang telah tua atau kekurangan makan dapat berubah menjadi gram negatif. Kelima, perlakuan khusus.

Pada mekanisme pengecatan gram, sifat gram terutama ditentukan oleh sifat-sifat fisik dan kimia membran sel dan membran sitoplasmanya. Dinding sel dan membran sitoplasma bakteri-bakteri gram positif mempunyai afinitas yang besar terhadap kompleks cat kristal violet dan yodium, sedang afinitas pada bakteri gram negatif sangat kecil. Perbedaan sifat fisik dan kimia dinding sel dan membran sitoplasma ini memegang peranan penting dalam menentukan sifat gram. Tetapi sampai beberapa jauh pengaru tersebut belum diketahui dengan jelas lalu difiksasi dengan spiritus. Pada waktu pengecatan, larutan kristal violet dan yodium menembus sel-sel bakteri gram positif maupun sel bakteri gram negatif. Pada sel bakteri gram positif, zat-zat ini mambentuk suatu senyawa yang sukar larut, juga tidak larut dalam peluntur. Hal ini tidak terjadi pada bakteri gram negatif, akibatnya cat dapat dilunturkan. Pada pemberian cat penutup (cat lawan) sel bakteri gram positif tidak diwarnai, sedang sel bakteri gram negatif diwarnai sehingga warnanya kontras terhadap cat utama.

Bakteri yang masih hidup tidak nampak jelas bentuk maupun sifat-sifat morfologi lainnya. Bakteri tunggal, yaitu yang berupa satu sel saja hanya kelihatan bening saja, walaupun bakteri itu diambilkan dari suatu koloni tertentu. Oleh karena itu, untuk memperlihatkan bagian-bagian sel diperlukan pewarnaan. Untuk memperlihatkan inti atau bahan inti ada pewarnaan tersendiri, untuk melihat flagel ada cara lain lagi; demikian pulan untuk melihat spora ada cara yang khusus untuk itu saja. Misalnya, pewarnaan inti disebut juga pewarnaan secara feulgen. Pewarnaan yang lain adalah cara Giemsa, pewarnaan secara Gram, secara Neisser dan masih banyak lagi. Mikroorganisme sangat sukar dilihat dengan menggunakan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Dengan alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme atau latar belakangnya. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga mikroorganisme tersebut terlihat kontras dengan sekelilingnya.

Seperti yang telah diketahui yaitu pewarnaan sederhana terdiri atas pewarnaan basa atau pewarnaan langsung (positif), pewarnaan asam atau pewarnaan tak langsung (negatif) dan pewarnaan gram yang bertujuan untuk mengamati bentuk morfologi dari bakteri. Pada pewarnaan basa (positif) menggunakan larutan methilen blue sebagai zat warnanya untuk memberi warna pada bakteri yang akan diamati di bawah mikroskop, sedangkan pada pewarnaan asam (negatif) menggunakan tinta cina atau nigrosin untuk memberi warna pada lingkungan disekitar mikroba.

Berdasarkan hasil pengamatan pewarnaan basa (langsung atau positif) tampak bakteri dengan bentuk morfologinya berbentuk kokus. Selain bentuk bakteri tersebut, terlihat variasi-variasi yang dibentuk oleh bakteri tersebut, seperti morfologi bakteri yang dibentuk oleh bakteri berbentuk kokus (bulat), yakni bakteri berbentuk monokokus (bakteri yang terdapat hanya satu bakteri saja). Sedangkan pada pengamatan pewarnaan asam (tak langsung atau negatif) tampak bakteri berbentuk kokus (bulat). Pada pewarnaan gram, yang ditemukan adalah bakteri gram negatif yang berbentuk kokus.

V. PENUTUP

A.     Kesimpulan

Dari hasil pengamatan pada praktikum ini, maka dapat disimpulkan sebagai berikut:

1.     Secara kimiawi, zat pewarna sel bakteri terdiri dari komponen organik yang   mengandung cincin benzena, dilengkapi dengan gugus kromofor dan auksokrom.

2.     Teknik-teknik pengecatan morfologi bakteri diantaranya yaitu pengecatan sederhana, dan pengecatan diferensiasi .

3.     Pada pewarnaan basa (langsung atau positif) pada bakteri 10^-5, terdapat jenis bakteri yang berbentuk kokus (bulat). Sedangkan pada pewarnaan asam (tak langsung atau negatif) pada bakteri 10^-5, terdapat satu jenis bakteri, yakni bakteri berbentuk kokus. Pengecatan gram meliputi 4 tingkatan. Pertama, pemberian cat utama dimana digunakan larutan cat crystal violet warna ungu. Kedua, pengintesifan cat utama dengan menambahkan larutan mordan (JKJ). Ketiga, pencucian (deklorisasi) dengan menggunakan larutan alkohol. Dan keempat adalah pemberian cat penutup (cat lawan, counterstain) dengan menggunakan larutan safranin yang berwarna merah.

B.     Saran

Adapun saran saya pada praktikum kali ini yaitu sebaiknya para praktikan memberikan penjelasan tentang materi yang akan diparaktekkan sehingga pelaksanaan praktikum akan lebih lancar.

DAFTAR PUSTAKA

Adam. 1992. Dasar-Dasar Mikrobiologi dan Parasitologi. FK-UI Press. Jakarta.

Dwidjosoeputro, D. 2003. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta.

Hadioetomo, Ratna Siri. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek “Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium”. Gramedia. Jakarta.

Kimball, John W. 1994. Biologi Jilid 3 Edisi Kelima. Erlangga. Jakarta.

Pelczar, J. Michael. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Universitas Indonesia Press. Jakarta

Sandjaja,B. 1992. Isolasi dan Identifikasi Mikrobakteria. Widya medika. Jakarta.

Waluyo, Lud. 2007. Mikrobiologi Umum. Universitas Muhammadiyah Malang Press. Malang.